Em fins de 1902, em meio a divergências com Oswaldo Cruz sobre a política de produção de soros e vacinas do Instituto Soroterápico Federal, o barão de Pedro Afonso deixou sua direção. No dia 9 de dezembro, Oswaldo Cruz foi nomeado diretor-geral em substituição a Pedro Afonso.
Mal acabara de tomar posse na direção do Instituto, Oswaldo foi convidado a assumir a Diretoria Geral de Saúde Pública (DGSP) em substituição a Nuno de Andrade. Subordinada ao Ministério da Justiça e Negócios Interiores, a DGSP tinha entre suas atribuições a coordenação dos serviços sanitários dos portos e a realização de estudos sobre as doenças infecciosas.
Oswaldo estava com 30 anos e, fora dos meios médicos, quase ninguém o conhecia. Não obstante, ao ser empossado, em 23 de março de 1903, expôs um detalhado plano para erradicar a febre amarela do Rio de Janeiro em um prazo máximo de três anos. Assumiu, também, o compromisso de derrotar duas outras enfermidades que frequentemente irrompiam na capital federal em violentas epidemias: a varíola e a peste bubônica.
As campanhas sanitárias eram parte de um projeto ainda mais ambicioso de reforma urbana, conhecida como Reforma Pereira Passos por referência ao engenheiro que a conduziu, Francisco Pereira Passos, nomeado prefeito da capital federal, em 1903, pelo presidente da República Francisco de Paula Rodrigues Alves.
Para colocá-las em prática Oswaldo precisava, antes, legitimar a sua ação. Por isso, tratou logo de elaborar o projeto de uma nova legislação sanitária para acabar com a dualidade de poderes entre o governo e a prefeitura da capital federal no trato da saúde pública. Aprovada no Congresso Nacional em janeiro de 1904, a nova lei transferiu para a DGSP o comando de todas as ações na capital. O órgão passou a incorporar, entre outras atribuições, os serviços de higiene defensiva, a polícia sanitária, a profilaxia das doenças contagiosas e as atividades de higiene domiciliar.
As campanhas contra a febre amarela e a peste bubônica, apesar das desconfianças e oposições que suscitaram, foram vitoriosas. Já em 1904, Oswaldo podia comemorar o declínio acentuado dos índices de morbidade e de mortalidade de ambas as enfermidades, tendência que se confirmaria nos anos seguintes. Quanto à varíola, o sucesso não foi o mesmo. Baseada na vacinação compulsória, a campanha contra essa doença foi duramente combatida na imprensa e até nos meios médicos, culminando com a eclosão da Revolta da Vacina em 1904. Quatro anos mais tarde, suspensa a obrigatoriedade da vacinação, um novo surto da doença voltaria a assolar a capital.
Com as epidemias de peste e de febre amarela sob controle, Oswaldo pôde estender suas ações para outras localidades. Em 1905 e 1906, realizou duas longas expedições aos portos marítimos e fluviais do país, trabalho que permitiu um mapeamento preliminar das condições sanitárias de diferentes regiões do território brasileiro.
Prestigiado pelo sucesso da campanha contra a febre amarela, Oswaldo Cruz foi mantido à frente da Saúde Pública durante o governo de Afonso Pena (1906-1909). Nesse período, tentou fazer do combate à tuberculose a sua nova missão. No entanto, sem o apoio do Executivo, seu plano não iria adiante. Assim, quando, em novembro de 1909, passou a vigorar a lei que proibiu a acumulação de cargos no serviço público federal, Oswaldo não teve dúvidas: decidiu-se por sua casa. E esta ficava na antiga fazenda Manguinhos, onde agora reinava o Instituto Oswaldo Cruz.