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Em 1906, pouco antes de Alcides Godoy anunciar a descoberta da vacina contra a peste da manqueira, o governo de Minas Gerais sugeriu a Oswaldo Cruz a criação de uma unidade do Instituto em Belo Horizonte, a jovem capital dos mineiros. Naquela época, a doença chegava a dizimar de 40% a 80% dos bezerros em todo o estado, causando graves prejuízos aos agricultores. Inaugurada em agosto daquele ano, a primeira filial do Instituto foi entregue aos cuidados de Ezequiel Dias, um dos mais antigos colaboradores de Oswaldo.

Além do controle das epizootias que grassavam no estado e da preparação de soros e vacinas, a unidade passou a realizar pesquisas sobre várias enfermidades. O próprio Ezequiel Dias deixou importantes contribuições para o conhecimento de doenças como a leucemia, a adenomicose – uma infecção pulmonar causada por fungo – e a chamada peste dos pulmões, que acomete os bezerros. Outra vertente significativa de estudos desenvolvidos pelos cientistas da filial foram as investigações sobre a doença de Chagas, especialmente as pesquisas sobre a distribuição geográfica do barbeiro e seus índices de infecção pelo Tripanossoma cruzi.

No mesmo ano em que Ezequiel Dias inaugurou a filial de Belo Horizonte, Oswaldo Cruz enviou o cientista Antônio Cardoso Fontes para combater a peste bubônica em São Luís, no Maranhão, e ajudar na organização dos serviços de saúde do estado. A partir desse trabalho, uma nova filial do Instituto seria criada em 1919, já depois da morte de Oswaldo.

Ainda durante a gestão de Oswaldo Cruz, Artur Neiva organizou, em 1914, uma filial do Instituto em Pelotas, no Rio Grande do Sul. A unidade, no entanto, teve existência efêmera.

Com a vitória da Revolução de 1930, o governo diminuiu os recursos destinados ao Instituto Oswaldo Cruz e a suas filiais, provocando, já no ano seguinte, o fechamento da unidade do Maranhão. A filial de Belo Horizonte, que em 1922 passara a se chamar Instituto Ezequiel Dias, continuou em funcionamento, mas, em 1936, foi transferida para o governo de Minas Gerais. Neste último ano, foi inaugurado pelo governo do Pará o Instituto de Patologia Experimental do Norte (IPEN), que passou a funcionar como um instituto associado.

Em dezembro de 1937, um decreto baixado pelo presidente Getúlio Vargas proibiu o Instituto Oswaldo Cruz de manter filiais em qualquer parte do território nacional.