Com a morte do pai, Bento Gonçalves Cruz, em 1892, Oswaldo Cruz tornou-se responsável pelo sustento da mãe e de suas quatro irmãs. Nessa época, a pesquisa em microbiologia dava ainda os seus primeiros passos no Brasil, tornando praticamente impossível para um médico recém-formado abrir mão do exercício da clínica. Além do mais, Oswaldo estava de casamento marcado e logo sua família iria aumentar. A saída foi, então, assumir o consultório do pai na casa da rua Jardim Botânico e o emprego que este mantinha no ambulatório da Fábrica de Tecidos Corcovado.
Oswaldo casou-se no início de 1893 e recebeu de presente do sogro, Manuel da Fonseca, um moderno laboratório de análises clínicas que mandou instalar no primeiro pavimento de sua nova residência no Jardim Botânico. Já no ano seguinte mais uma oportunidade surgia: Egidio Salles Guerra, seu futuro médico e biógrafo, o convidou para trabalhar na Policlínica Geral do Rio de Janeiro, uma instituição filantrópica criada em 1882 por iniciativa do médico Carlos Arthur Moncorvo de Figueiredo. Sua tarefa: montar e dirigir um laboratório de análise patológica e de microbiologia, ligado ao Serviço de Moléstias Sifilíticas e da Pele, chefiado por Antonio José Pereira da Silva Araújo.
Oswaldo assumiu o encargo com grande dedicação, afinal a Policlínica era uma das poucas instituições do país a utilizar as teorias de Louis Pasteur no diagnóstico e tratamento das doenças infectocontagiosas. Lá, poderia trocar experiências e aplicar seus conhecimentos em microbiologia.
Era também um lugar propício para cultivar amizades. Com Salles Guerra, Antônio José Pereira da Silva Araújo, Aureliano Werneck Machado e Alfredo Porto, Oswaldo formou o “grupo dos cinco germanistas”, assim chamados pela dedicação com que se entregavam ao estudo do alemão, um dos idiomas, além do francês, em que eram publicados os textos médico-científicos mais atualizados da época.
Ao concluir sua temporada de estudos em Paris e regressar ao Brasil em agosto de 1899, Oswaldo Cruz reassumiu essas atividades clinicas. Paralelamente, inaugurou na travessa de São Francisco, atual rua Ramalho Ortigão, um consultório de urologia e um moderno laboratório de pesquisas e análises clínicas – o primeiro do gênero na cidade. Também nessa época ajudou a fundar a Policlínica de Botafogo, instituição de caráter filantrópico idealizada pelo médico Luiz Pedro Barbosa.